تتطلب دراسة الآليات الغامضة لتخليق الدهون الجديدة (DNL) فهماً عميقاً حول دورها الحيوي في تطور الثدييات، حيث تلعب دوراً مهماً في إنتاج الأحماض الدهنية اللازمة لتكوين الأغشية، وتخزين الطاقة، والإشارات الخلوية. تكشف الأبحاث الحديثة عن روابط معقدة بين DNL والأمراض مثل السرطان وأمراض الكبد الدهنية المرتبطة بالخلل الأيضي، مما يستدعي استكشافاً موسعاً لهذه العمليات. تتمحور المقالة حول إنزيم FASN، العنصر المحوري في DNL، وكيفية استهدافه كعلاج محتمل للأمراض المختلفة، بدءًا من السرطان إلى حالات العدوى الفيروسية. سنستعرض الأبحاث المتقدمة حول تثبيط FASN وآثاره المحتملة على الصحة، بالإضافة إلى الاستراتيجيات الجديدة في تصميم المركبات الحيوية التي يمكن أن تساهم في تطوير علاجات فعّالة بأمان.
دور تحلل الدهون الجديد في التطور والمرض
تحلل الدهون الجديد (DNL) هو عملية حيوية تلعب دورًا أساسيًا في تطوير الثدييات من خلال إنتاج الأحماض الدهنية اللازمة لتكوين الأغشية، تخزين الطاقة، إشارة الخلايا، وتعديلات البروتينات. تعمل هذه العملية في حالات مرضية مثل السرطان ومرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD) والعدوى الفيروسية والطفيلية. في هذه الحالات، يتم عادة زيادة نشاط DNL إلى جانب البروتينات المعنية بهذه المسارات. من بين هذه البروتينات، يعد إنزيم فاسن (FASN) هو الإنزيم الرئيسي في تحلل الدهون الجديد حيث يقوم بتكثيف الأسيتيل-كوا وميلونيل-كوا لتكوين حمض البالميتات الذي يتكون من 16 ذرة كربون.
يدل الارتفاع في نشاط تحلل الدهون الجديد خلال حالات مرضية معينة على أن هناك علاقة قوية بين الأيض والمرض. على سبيل المثال، الحركة غير المنضبطة لتحلل الدهون قد تسهم في تطور الأورام والالتهاب في الكبد. تسلط الدراسات السريرية الضوء على فاعلية مثبطات FASN مثل الدنيفانسيت التي تظهر نتائج واعدة في تجارب المرحلة الأولى والثانية والثالثة لعلاج هؤلاء المرضى. ومع ذلك، البحث عن التأثيرات السلبية المحتملة لفقدان تحلل الدهون الكامل يعكس ضرورة الاستمرار في دراسة آلية FASN لفهم تأثيرها بشكل أفضل على الصحة والمرض.
الهيكل والآلية الإنزيمية لفاسن
يظهر إنزيم FASN سمة فريدة كميغاسينثاز من نوع I، والذي يحتوي على ستة مجالات حفزية. تتضمن آلية عمله نظام بروتين ناقل ينقل المواد الوسيطة بين هذه المجالات، مما يعكس تعقيد العملية الأيضية. يختص الـ ACP (البروتين الناقل) في نقل المواد للحد من التفاعلات العكسية ويعمل على توجيه المواد الوسيطة إلى المواقع الصحيحة خلال العملية الإنزيمية.
استخدام تقنيات مثل تصوير الإلكترون المجهري والتوضيحات البلورية قد أتاح فهمًا أفضل لهيكل FASN، الذي يتضمن جوانب غير متوقعة مثل المعمارية المعقدة للدوائر. إن محاولة فهم آلية عمل الـ ACP في عملية FASN يعتبر تحديًا بسبب الطابع العابر للتفاعلات بين المجالات. وبالرغم من حصول تقدم في هذا المجال، إلا أن العديد من الأسئلة لا تزال قائمة حول كيفية تفاعل FASN مع المواد الوسيطة وما إذا كانت هذه التفاعلات يمكن تعزيزها لاستخدامات علاجية جديدة.
التطبيقات السريرية لاستهداف فاسن
في الوقت الذي تظهر فيه دراسات ما قبل السريرية نتائج واعدة لاستهداف FASN كعلاج للأمراض الأيضية، فإنه من المهم مراعاة التأثيرات الجانبية المحتملة. على سبيل المثال، تقليل نشاط FASN بالكامل قد يؤدي إلى تقليل إنتاج الصفائح الدموية والعيوب في التعلم. يُظهر ذلك ضرورة التوازن بين فائدة تثبيط FASN وما قد ينتج عنه من آثار جانبية تعتبر غير مرغوبة.
توفر الأبحاث الحالية التي تركز على التفاعلات المختلفة بين بروتينات FASN والمواد الوسيطة إحساسًا معززًا بالاستفادة من هذه التفاعلات لتطوير أدوية جديدة تتجنب التأثيرات الجانبية. مع تطور الأبحاث، تظهر مجالات جديدة للابتكار في التصميم العلمي، مما يفتح آفاقًا جديدة لاستهداف DNL كطريقة علاجية للأمراض المزمنة.
فهم أكبر للتفاعلات بين مجالات FASN
يضفي الفهم العميق للتفاعلات بين مجالات FASN طابعًا معقدًا على عمليات الأيض. يبين البحث الدؤوب عن أشكال مختلفة لـ FASN ووظائفها المتعددة في البيئات الخلوية المختلفة كيف يمكن استغلال هذه المعرفة لتطوير علاجات جديدة. بالإضافة إلى ذلك، تشير النتائج إلى ضرورة تكامل فحص فاعلية العلاجات المستقبلية مع فهم عميق للآثار الجانبية المحتملة لفقدان الوظائف الأيضية الطبيعية.
إن الدراسات الجديدة التي تركز على دور الـ ACP في النشاط الإنزيمي، وما إذا كانت هذه البروتينات يمكن استخدامها لتطوير أشكال جديدة من العلاج، تعكس رؤية مثيرة للمستقبل. تكامل المعرفة المتعمقة حول بنية FASN وآلية عمله مع التطبيقات السريرية المحتملة يمكن أن يُحدث تغييرات ثورية في كيفية علاج الأمراض الأيضية والسرطانية في المستقبل.
الحركة الديناميكية لمناطق الإنزيم في FASN البشري
تظهر الأبحاث الحديثة حول إنزيم FASN البشري (Fatty Acid Synthase) أن هناك مستوى معقدًا من الحركة الديناميكية بين المناطق المختلفة لهذا الإنزيم. يتمثل أحد الاكتشافات المهمة في أن تغييرًا بسيطًا بمقدار 5 درجات يمكن أن يجعل منطقة التكثيف في الحالة الأولى تتحرك نسبيًا مع المناطق الأخرى، بينما يمكن أن تصل الحركة إلى 90 درجة في بعض الحالات. هذه الحركة تسمح للإنزيم بتنظيم عملية تخليق الأحماض الدهنية بفعالية. يُظهر نموذج مرئي (الشكل 2) هذه الديناميكية، موضحًا كيف أن المناطق الصلبة والمتحركة تتفاعل في عملية التكثيف، مما يبرز أهمية التنسيق بين هذه المناطق المختلفة.
عند تحليل الحالات المختلفة لـ hFASN، يمكن ملاحظة أن الحركات الناتجة يمكن أن تكون مفتاحية لفهم كيفية عمل هذا الإنزيم. على سبيل المثال، تمثل إعادة بناء النموذج اليدوي الحركات الكبيرة التي تحدث، والتي قد تكشف عن كيفية مشاركة ACP (Acyl Carrier Protein) وتفاعلاتها مع باقي أجزاء الإنزيم. بهذا الشكل، يمكن التفكير في الديناميكية ليس فقط كحركات فيزيائية بل كجزء أساسي من وظيفة الإنزيم بشكل عام.
يستنتج من هذه النتائج أن FASN لا يعمل كآلة ثابتة، بل ككيان ديناميكي تتغير فيه الوظائف والتفاعلات استجابةً للتغيرات في البيئات الكيميائية المميّزة.
دور أكسدة NADPH في تفاعلات الإنزيم
تلعب حالة أكسدة جزيء NADPH دورًا مهمًا في التفاعل مع المناطق النشطة للإنزيم hFASN، حيث تظهر التركيبات مع NADPH كثافة قوية تُظهر قرب الجزيء من البقايا الحفزية المهمة مثل K1995 وS2021 وY2034. هذه التفاعلات والتراكمات الجزيئية الحيوية تُعتبر مفتاحًا لفهم كيفية عمل الإنزيم.
أثناء الأبحاث، تم جمع بيانات إضافية لـ hFASN التي تتضمن NADP+ لمنع التحولات. حيث أظهرت النتائج أن التغيرات في هياكل النطاقات الحفزية تظل موجودة بعد أكسدة NADPH، مما يسهل فهم كيفية تحرير NADP+ بعد انتهاء التفاعلات. يُظهر هذا الاكتشاف دور الحالة الكيميائية في تحديد وقت وكيفية تفاعل الجزيئات مع الموقع النشط داخل الإنزيم.
من المهم ملاحظة أن الأبحاث السابقة أظهرت أن NADP+ يمكن أن يساهم في تحسين بعض الجوانب الوظيفية للإنزيم على المستوى البنيوي. ومع ذلك، تشير النتائج الحديثة إلى أن التركيز الرئيسي ينبغي أن يكون على كيفية تأثير أكسدة NADPH على تفاعلات الحفز والتفاعل بين ACP وKR domain ودوره في تفاعلات تخليق الأحماض الدهنية.
آلية اتصال ACP مع النطاقات النشطة
تُعتبر منطقة DH في إنزيم hFASN مهمة بشكل خاص لتفاعلات فوسفات البانتوثينيك المعقدة مع ACP، حيث تم الحصول على كثافة إضافية تثبت وجود ACP في هذه المنطقة. تمثل هذه الظهورات بداية لفهم كيف يمكن أن تنقل ACP المنتجات الوسيطة بين النطاقات الحفزية المختلفة. النموذج الناتج من دراسات Cryo-EM يظهر كيفية تفاعل ذراع الفوسفات مع منطقة النشط للحفاز H878.
تشير النتائج إلى أن التفاعل بين ACP وDH هو تفاعل ديناميكي يتجلى في التحولات الناجحة للمواد الوسيطة، مما يتيح تخليق الأحماض الدهنية بشكل فعال. تدرس الأبحاث الجوانب الكهربائية لهذه التفاعلات، مشيرة إلى أن تفاعل الشحنات المختلفة يلعب دورًا محوريًا في نجاح التفاعل. تم الكشف عن مناطق مشحونة سلبية على ACP تتفاعل مع مناطق مشحونة إيجابية على DH domain.
تعتبر الدراسات التي أجريت على الطفرات المختلفة في mFASN وسيلة للتحقيق في تأثير هذه التفاعلات الكهربائية على النشاط الإنزيمي. تشير النتائج إلى أن الطفرات الخاصة بالمناطق المشحونة أدت إلى انخفاض كبير في النشاط الإنزيمي، مما يؤكد أن التفاعل بين ACP وDH يعتمد بشدة على التوافق الكهربائي والفيزيائي بين البروتينين، وهو عامل حاسم في عملية تخليق الأحماض الدهنية.
المتطلبات الأساسية لنشاط إنزيم FASN
يعتبر إنزيم FASN (Fatty Acid Synthase) من الإنزيمات الأساسية التي تلعب دورًا حيويًا في تخليق الأحماض الدهنية. يتطلب نشاط هذا الإنزيم تفاعلات متعددة بين مختلف مكونات ومعقدات البروتين. من بين هذه المتطلبات، نجد أهمية ذراع الفوسفوپانتثيين (Ppant arm) المتعلقة بوحدة البروتين المسؤولة عن الوساطة في نقل الركائز. عندما يتم إجراء طفرات على مواقع معينة مثل G2157، فإن ذلك يعيق قدرة الفوسفوپانتثيين على الارتباط بوحدة ACP (Acyl Carrier Protein)، مما يؤدي إلى نقص النشاط الحيوي للإنزيم. هذه الوضعية تبرز على نحو ملحوظ أهمية ذراع الفوسفوپانتثيين بالنظر إلى دورها التأثيري على النشاط الوظيفي للإنزيم.
أجريت دراسات مكثفة لتحديد تأثير الطفرات على الأنشطة المختلفة لإنزيم FASN. وبدون وجود ذراع Ppant، توقفت الأنشطة الحيوية للإنزيم بشكل كامل تقريبًا. أمّا الطفرات الموجودة على الشركاء التفاعليين لوحدة ACP، مثل M2158A و V2160A، فلم تظهر تأثيرًا كبيرًا على النشاط العام للإنزيم، مما يدل على أن وحدات أخرى تلعب دورًا أيضًا في النشاط الإنزيمي.
ومن التجارب المنفذة، تم تطوير خلايا HepG2 المعدلة وراثيًا، حيث تم تجديد التعبير عن إنزيم FASN. أظهرت النتائج أن طفرات معينة مثل R883A وR883E كانت لها تأثيرات سلبية على تخليق الأحماض الدهنية. في المقابل، أظهرت الطفرات الأخرى مثل I924A وR1105A مستويات منخفضة من تخليق الأحماض الدهنية، مما يعكس التأثير القوي للطفرات على التركيب البروتيني للإنزيم ووظائفه.
أهمية التفاعل بين ACP وFASN
يُعتبر التفاعل بين ACP وإنزيم FASN عاملًا محوريًا في قلفة التفاعلات الكيميائية اللازمة لتخليق الأحماض الدهنية. يتطلب ذلك تفاعلات دقيقة بين الجزيئات، حيث يسهل ACP نقل الركائز إلى الموقع النشط للإنزيم. في تطوير المكونات الخلوية، تم اختبار تأثيرات الطفرات على نشاط FASN، حيث وجد أن وظائف ACP ضرورية لتوصيل الوسطاء إلى المواقع النشطة لأنشطة التحفيز. يؤدي تفكك هذا التفاعل إلى عدم قدرة الخلايا على تخليق الأحماض الدهنية، وبذلك يتم التأكيد على أهمية توصيل ACP في تنفيذ النشاط الإنزيمي.
تم استخدام خلايا كبدية معدلة جينيًا لدراسة تأثير التفاعلات المعطلة. فقد أظهرت النتائج أن تدهور النشاط الإنزيمي للمتحولات M1577 وR1841 كان لها عواقب وخيمة، حيث تُظهر هذه الطفرات تأثيرًا تغييريًا واضحًا على قدرة FASN في تخليق الأحماض الدهنية. تتضاف هذه النتائج إلى الفهم الأوسع لدور ACP في تفاعل إنزيم FASN، والدور المعقد الذي تلعبه الوحدات المختلفة في تنظيم النشاط الإنزيمي.
ديناميكيات التركيب البروتيني لإنزيم FASN
تُظهر دراسة التركيب البروتيني المتعلق إنزيم FASN أن الديناميات التركيبية تلعب دورًا مهمًا في التفاعلات المختلفة التي تمر بها الوحدات البروتينية. تساعد الديناميات على تنسيق التفاعلات بين المجالات المختلفة، مما يعزز من فعالية عملية التخليق. وقد اقترح الباحثون أن تكوينات البروتين الديناميكية بين المناطق المختلفة تساهم في تحسين الإنهاء المتناغم لدورات التفاعل، مما يزيد من كفاءة إنزيم FASN.
تشير الدراسات إلى أن التكوينات المختلفة للإنزيم تؤثر على كيفية تفاعل وحدات ACP مع المناطق النشطة المختلفة. ينطوي ذلك على تفاعل غير متزامن بين وحدات ACP والمجالات الحفزية، مما قد يكون له تأثير كبير على إجمالي إنتاج الأحماض الدهنية. وتظهر التحليلات أن تبادل أطراف البرميل بين مناطق الإنزيم يساهم في فحص التوازن بين مجالات الاستجابة، مما يحسن من فعالية المرحلة الانتقالية.
علاوة على ذلك، تُظهر البيانات المستخلصة من التجارب في الخلايا المعدلة جينيًا مكافأة تركيبيّة قوية لديناميات إنزيم FASN. تم تحديد التأثيرات الطيفية المعقدة لهذه الديناميات على الإنتاجية النهائية للإنزيم، مما يساعد في تعزيز الفهم لكيفية تحسين الآليات المعقدة المرتبطة بتخليق الأحماض الدهنية.
الآفاق المستقبلية لتطوير مثبطات إنزيم FASN
تفتح نتائج الأبحاث حول إنزيم FASN آفاقًا جديدة لتطوير مثبطات محتملة يمكن أن تستهدف الأجزاء الحيوية في عملية إنتاج الأحماض الدهنية. من خلال دراسة التفاعلات الوظيفية بين ACP والإنزيم في سياق التغيرات الجينية، الأهداف نفسها يمكن استخدامها لتصميم مثبطات ذات توافق عال من لجنة معينة. هذا التطوير يمكن أن يلعب دورًا حيويًا في تنظيم مستويات الأحماض الدهنية ويعزز من التطبيقات العلاجية المحتملة لتقليل مخاطر الأمراض المرتبطة باختلال نظم الدهون.
تعتبر طريقة استهداف التفاعلات بين المكونات البروتينية المختلفة وسيلة واعدة في تطوير الأدوية، حيث يمكن التركيز على المناطق المشاركة في حركة ACP وتفاعلاته. بالاستناد إلى النتائج المستخلصة من دراسات التجارب الخلوية، يمكن أن يشكل هذا النهج استراتيجية فعالة لتقليل مستويات الإنزيمات المفرطة النشاط التي قد تتسبب في مشكلات صحية مثل السرطان.
باختصار، إن الفهم العميق لبنية إنزيم FASN والتفاعلات المعقدة بين مكوناته يقود إلى تحسينات في تطوير مثبطات فعالة يمكن أن تحد من وظائفه في تخليق الأحماض الدهنية. ويمكن أن تلعب هذه المثبطات دورًا كبيرًا في الأبحاث المستقبلية حول الأمراض الأساسية، مما يعزز من الابتكارات في مجالات الطب والصيدلة.
هيكل ووظيفة FASN البشري
تم تحديد الهيكل المتعلق بمركب FASN البشري (FAS) خلال عدة حالات شكلية باستخدام تقنيات التبريد الإلكتروني (cryo-EM). تم الكشف عن بنية مركب FASN بتفاصيل غير مسبوقة في حيوانات الثدييات، لا سيما عند مجالات ACP وDH وER. تعتبر هذه النتائج هامة لأنها تدعم نموذج التفاعل بين المجالات ACP وDH وER بشكل مستقل عن الحالة الشكلية للإنزيم.
على سبيل المثال، قد تم ملاحظة أن الطفرات في واجهة ACP مع مجالات DH وER أثرت بشكل ملحوظ على نشاط FASN الكلي في البيئات التجريبية والخلوية. هذا يفتح المجال لتطوير استراتيجيات جديدة تستهدف FASN باستخدام جزيئات صغيرة تتجنب المناطق النشطة المحفوظة. وجدت الدراسة أيضاً أن الطفرات في واجهة DDI على النطاق المحفز كانت أكثر ضرراً على النشاط الكلي مقارنة بالطفرات على واجهة ACP، مما يشير إلى أنه يتعين القيام بتحسين واجهة التفاعل على النطاقات المحفزة في أنظمة PKS المصممة لتعزيز الإنتاج.
الاختلافات بين الأنظمة البكتيرية والثديية
في معظم البدائيات، يتم التعبير عن الإنزيمات المحفزة لتخليق الأحماض الدهنية كالبروتينات الفردية بنظام النوع الثاني. ومع ذلك، تطورت هذه العمليات في الأحياء مثل الخمائر والثدييات لتشكل أنظمة معقدة تُعرف باسم النظام النوع الأول، حيث تدمج الآليات المحفزة ضمن مجمعات كبيرة. على سبيل المثال، يعبّر FASN الخميري عن سلاسل ألفا وبيتا كجينات منفصلة، مما يؤدي إلى تشكيل هيكل ضخم يشبه القفص ويحتوي على مجموعات من الوظائف المحفزة.
تمتاز الأنظمة المختلفة بآليات تحفيز متحفظة، ولكن لوحظ أن تفاعلات ACP مع النطاقات المحفزة تختلف بشكل كبير بين الأنظمة. فبينما يُظهر الهيكل المرتبط بـ FASN البشري تفاعلًا معقدًا بين ACP وDH، يظهر تفاعل FASN الخميري نسقًا أقل تفاعلية، مما يبرز تنوعه الهيكلي ودوره الفاعل في عملية التخليق.
آليات الشحن والتوافق بين المجالات
تظهر بيانات cryo-EM تغييرات هيكلية كبيرة بين المناطق المشبعة والمعدّلة في FASN البشري. هذه التغييرات الهيكلية تسبب عدم تماثل عبر الديمر كما تم الإبلاغ عنه سابقًا. تشير البيانات الجديدة إلى أن FASN البشري يقوم بتخليق حامض البالمتيك بشكل غير متزامن عبر الديمر، مما يمكن أن يؤثر على فعالية وطبيعة العمليات التفاعلية. يعتبر هذا الاكتشاف أساسيًا لفهم كيفية تفاعل مجالات ACP وKS وMAT في حالات شكلية معينة.
يعتبر هذا البحث أيضًا علامة على أهمية العوامل التنظيمية في تحديد كيفية تجاوز المركبات الحركية التنافسية. على سبيل المثال، أظهرت النتائج أن الشحن غير المتزامن لـACP قد يكون مهمًا لضمان التعديل السليم ونقل المواد المتوسطة بين الوحدات التفاعلية في FASN البشري. تشير هذه الآلية إلى أن الأشكال المختلفة للإنزيم قد تحمل خصوصيات معينة تتعلق بمعدل التفاعل ونوع المواد المركبة.
الابتكار في تصميم مثبطات FASN
أدت الدراسات إلى تحديد مجالات جديدة لاستهداف FASN باستخدام جزيئات صغيرة. العيوب التركيبية الملاحظات عند التفاعل بين المجالات، خاصة في أماكن الـ DDI وACP، تشير إلى فرص أخرى لاستهداف نشاط FASN بالأسلوب الدقيق. يمكّن هذا التحليل من تطوير مثبطات فعالة لمكافحة الأمراض مثل السرطان، حيث أن FASN يشغل دورًا رئيسيًا في تكوين الأحماض الدهنية اللازم لنمو الخلايا السرطانية.
تقدم هذه الجهود فرصة حقيقية لتجديد أساليب العلاج المتاحة، ويمكن تخصيص أدوية تستهدف المواقع الأقل حفظًا في الإنزيم، مما يقلل من الآثار الجانبية المحتملة. جدير بالذكر أن الأبحاث تواصل في تحسين الفهم حول الآليات الجزيئية الخاصة بتفاعل ACP، مما يؤدي إلى تبني نماذج علاجية جديدة. يمكن أن تؤدي هذه الفكرة إلى المستقبل الأكثر إشراقًا في مجال التغذية الطبية وعلم الأحياء الدقيقة.
تحضير عينة Cryo-EM
لتجهيز عينة Cryo-EM، تم تخفيف بروتين hFASN إلى تركيز 4 ملغ/مل وتهيئته باستخدام ركائز محددة بتركيز 1 مللي مول. بعد ذلك، تم السماح للعينة بالتفاعل لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة قبل تجهيز الشبكات. تم استخدام شبكات Quantifoil 300 Mesh Cu R0.6/1، والتي تم التخلص من الشحنة الكهربائية منها عن طريق تفريغها تحت الفراغ لمدة 1-2 دقيقة عند 0.25 مللي أمبير. أُضيف CHAPSO إلى العينة في التركيز النهائي 8 مللي مول، ثم تم تطبيق 3 ميكرولتر من العينة على الشبكات. تم استخدام جهاز VitroBot Mark IV لترشيح الشبكات لمدة 2-3 ثوانٍ تحت رطوبة 100% ودرجة حرارة 4 درجات مئوية.
تم جمع جميع بيانات Cryo-EM على مجهر Titan Krios مزود بكاميرا Gatan K3 وفلتر طاقة. عمل المجهر على جهد 300 كيلو فولت وتكبير موحد مقداره ×81,000. استخدمت برمجية Leginon لجمع بيانات تلقائية تتعلق بـ 19,291 فيلمًا، وتم استخدام نطاق زمني محدد لتقليل التعرض للضوء. استُخدمت برامج مختلفة لتحليل الصور، بدءًا من تصحيح الحركة إلى تقدير دالة نقل التباين (CTF), مما أدى إلى مجموعة من الصور المصفاة التي يمكن استخدامها لمزيد من المعالجة.
تشتمل خطوات معالجة البيانات على انتقاء الجسيمات وتصنيفها، حيث تم استخراج الجسيمات وتدريب نموذج Topaz على بيانات محددة. تم إنشاء عدة فئات من الجسيمات وتحسينها باستخدام تقنيات مختلفة لتحقيق تكرارا هائلا وتحسين المخرجات في النهاية. الهدف هنا هو الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد دقيقة تعكس التركيب البنيوي للبروتين.
جمع بيانات Cryo-EM ومعالجتها
تم جمع بيانات Cryo-EM على جهاز Titan Krios وتم تطبيق تقنيات حديثة مثل التقنيات الذاتية لجمع البيانات. تم جمع 19,291 فيلمًا بتحصيل متوسط قد يصل إلى 52.50 e− Å−2 عبر 40 إطارًا. استخدمت برامج RELION وcrySPARC لمعالجة البيانات وقياس تباين الصور. تم اختيار الجسيمات من 23 صورة واستخدمت لتدريب نموذج تلقائي على التقاط الجسيمات، والذي قد تم استخدامه لاحقًا لجمع 989,117 جسيمًا.
نتيجة للرشفة اليدوية المنهجية، تم تصنيف الجسيمات إلى عدة فئات. استُخدمت قواعد محددة لإعادة بناء الهيكل الحضوري لكل فئة، حيث احتفظت 8 فئات بعلامات هيكلية مشابهة لبروتين FASN. هذه العملية استلزمت دورات متعددة من التحسين البنيوي باستخدام نماذج متعددة، مما منح بيئة ثرية لفهم الآلية الموجودة في طي البروتينات المعقدة.
التركيز على المناطق الذاتية النشطة لبروتين hFASN كان أمرًا ضروريًا. تم القيام بفحص تخصصي للوصول إلى الخرائط ذات الدقة العالية، الأمر الذي سمح بالفهم المتعمق لآلية عمل البروتين عند تواجده بمشاركة النصوص الجينية المختلفة. كل طبقة من الخرائط تم فحصها يدويًا وتدقيقها باستخدام أدوات مثل DeepEMhancer ومراجعة دقتها على منصات مختلفة.
بناء النماذج الجزيئية والتحليل البنيوي
تم بناء النماذج الجزيئية باستخدام بيانات التفاعل والتقنيات المستندة إلى النموذج. استند كل نموذج إلى بيانات تتراوح دقتها بين 4 Å وأقل، مما مكن الفريق من وضع النماذج بدقة داخل الكثافة المشتقة. هذا شمل توصيل وحدات من الهيكل البلوري المتاح مع بروتينات الانتقال البنائية الأخرى لتحديد النسق الأفضل الذي ينطبق على الهياكل؛ مثل استخدام PDB 3HHD بتفاصيل دقيقة. هنا، كانت خطوة البناء تتطلب مهارات خاصة في التوافق المعقد، حيث تم تنسيق النماذج بشكل متزامن مع التركيب الهيكلي للبروتينات الأخرى ذات الصلة.
تم استخدام برنامج ChimeraX لتقييم النموذج ومقارنة المناطق الجزيئية التي أظهرها بروتين FASN. كما تم حساب المساحات السطحية القابلة للوصول وقياس الأبعاد باستخدام الأدوات المختلفة المتاحة لتحليل النماذج الجزيئية. ساهمت النتائج المستخلصة في تكوين فهم أكثر تعمقًا للآليات الأيضية التي يعمل بها البروتين في الظروف المورفولوجية المتغيرة.
القياسات الحركية للإنزيم
بدأت تجارب القياس الحركية بإذابة عينات بروتين mFASN تحت ماء جاري لإزالة أي رواسب، تمت بعدها معالجة العينة لتحديد تركيزات بروتين معينة. تم إعداد مكونات السلاسل الإنزيمية في بيئات محددة مع مراعاة الظواهر الكواشف. تراوحت تركيزات الكاشف بين 4 إلى 1000 ميكرومول، مما سمح بإنشاء منحنيات Michaelis-Menten. تم رصد النشاط الإنزيمي باستخدام قراءة الامتصاص لنقص NADPH، التي تم قياسها في طول موجي 340 نانومتر.
عند تحليل منحنيات Michaelis-Menten، تمت مراجعة نموذج النموذج الخاص بالمنحني الداعم ليفوق النماذج الأخرى. على هذا الأساس، حُددت الشروط المناسبة لمقارنة الأنشطة بين الأنواع المتحولة والبروتينات الأصلية. تم تحديد مستويات النشاط النسبي باستخدام ظروف تم تحفيزها بسبب المكونات الأساسية وأشارت النتائج إلى تطور نشاط الإنزيم التوافقي.
إنشاء خطوط الخلايا المحذوفة
تم تطوير خطوط خلايا د42 الخاصة بسرطان الكبد بالمورثات باستخدام تقنية CRISPR-Cas9، حيث تم التأكيد على تنفيذ العملية باستخدام مضادات FASN. محور التركيز كان الجين المسؤول والذي استهدفه الشريط المفرد RNA الموجود على المستوى الجزيئي. تأكدت نتائج التعديل بواسطة اختبار Western Blot، مما ساعد في عصر تقنيات الهندسة الجينية المتقدمة في دراسات السرطان والتمثيل الغذائي للعناصر الشحمية.
كانت التجارب خطوة فارقة في رصد التغيرات في إنتاج الأحماض الدهنية والتفاعل مع العناصر الغذائية من الجلوكوز، عبر القياسات المطورة بالتقنيات الحديثة مثل GC-MS. الجهود لقياس كمية الأحماض الدهنية وتغيير حدتها في بيئات مزروعة أخرى قدمت أساسًا علميًا للأنماط التي تتأثر فيها خلاياFASN التي تم تعديلها وفهم دور الأحماض الدهنية في تشكيل والارتقا بالأداء الوظيفي في الخلايا السرطانية.
رابط المصدر: https://www.nature.com/articles/s41586-025-08587-x
تم استخدام الذكاء الاصطناعي ezycontent
اترك تعليقاً